氮素及混菌发酵对苹果渣发酵饲料纯蛋白含量和氨基酸组成的影响

1.1 材料

菌种：酵母菌（Yeast）、黑曲霉A8（Aspergillus niger A8）及米曲霉（Aspergillus oryzae）由西北农林科技大学资源环境学院微生物资源研究室提供。

主料：烘干苹果渣，由乾县海升果汁厂提供。

发酵干原料：A为干苹果渣：尿素=19：1；B为干苹果渣：油渣粉：尿素=17：2：1。

发酵湿原料：发酵干原料：自来水=1：2。

培养基：PDA固体培养基。

1.2 方法

发酵剂制备：将活化好的酵母菌悬液1 mL均匀涂布于50 mL PDA固体培养基（250 mL三角瓶）上，28 ℃下培养3 d后加100 mL无菌水制得菌悬液，经血球计数板测定，其活菌数为7.0×10⁹个/mL。按相同方法制备黑曲霉A8及米曲霉孢子悬液，于28 ℃下培养5 d，所得孢子数分别为2.3×10⁹、1.7×10⁹ CFU/mL。

固态发酵：设发酵剂、灭菌方式及原料组成3个因素。发酵剂设不接菌（CK）、单接酵母菌（Y）、单接黑曲霉（H）、单接米曲霉（M）、酵母菌+黑曲霉（YH）、酵母菌+米曲霉（YM）6个处理。灭菌方式设自然发酵（CK,原料不灭菌）和灭菌发酵（原料121 ℃灭菌30 min）2个处理。原料组成：设原料A（苹果渣+尿素）和原料B（苹果渣+尿素+油渣）两种类型。试验共24个处理，每处理重复3次，以未发酵纯苹果渣原料作为对照。

步骤：按照1.1节中的比例配制发酵原料；称取50.0 g 发酵湿原料于150 mL组培瓶中，盖上瓶盖，121 ℃下灭菌30 min，冷却至室温后接入发酵剂并搅匀（单菌接种量为5 mL/瓶，混菌各2.5 mL/瓶），28 ℃培养72 h，发酵结束后将样品在45 ℃下鼓风烘干并粉碎；自然发酵中原料不灭菌直接接种发酵。发酵产物纯蛋白质含量测定：将烘干样品粉碎，过筛，称取0.500 0 g于小三角瓶中，加蒸馏水10 mL，在水浴锅中加热至微沸，维持15 min，加饱和CaCl₂1 mL，100 g/L KH₂PO₄ 2 mL，待出现白色絮凝物后，充分摇匀过滤，再用10 mL蒸馏水洗涤滤纸上的样品，直至洗出液无NH₄⁺(用钠氏试剂检验)，将滤纸连同滤物放入消煮管中，100 ℃烘干后各加入8 mL浓硫酸，以小漏斗盖住消煮管口，120 ℃碳化12 h后，用浓硫酸-过氧化氢法消煮后，定容至100 mL，选择适宜的稀释倍数采用靛酚蓝比色法测定样品中NH₄-N含量，再乘以系数6.25换算为纯蛋白质含量。

发酵产物中氨基酸组成测定：称取粉碎后的苹果渣在不灭菌自然条件下的发酵产物及苹果渣原料1.000 g放入水解管中，加6 moL/L盐酸10 mL，3~4滴新蒸馏苯酚，110 ℃水解22 h，冷却过滤定容；取溶液1 mL于5 mL容量瓶，40 ℃真空干燥，残留物用1 mL去离子水溶解，再干燥，反复进行两次，最后蒸干，用1 mL pH值2.2的缓冲液溶解，L-8900氨基酸分析仪测定。

2.1 不同处理对发酵产物得率的影响

由表1 看出：

①灭菌处理的发酵产物得率低于不灭菌处理，这是因为灭菌处理条件下微生物的生长状况优于不灭菌处理，微生物生长繁殖较快，发酵产物中菌体数目多，消耗的碳源、能源物质多，故发酵产物得率较低。

②原料B 发酵产物得率低于原料A，这是因为原料B中添加了油渣，为接入菌的生长提供了丰富的营养条件，微生物生长繁殖快，消耗了较多的碳源和能源。

③混菌发酵产物得率明显偏低，是因为混菌发酵时多菌体系中的黑曲霉分泌的纤维素酶、蛋白酶及果胶酶等水解酶促进了苹果渣中的碳水化合物与加入油渣中的蛋白质的水解，产生较多的小分子糖类及氨基酸，微生物生长状况优于单菌发酵体系，微生物生长繁殖快，使发酵产物中的菌体数目增多，消耗的碳源、能源物质相应增加，故发酵产物的得率降低。米曲霉产蛋白酶、淀粉酶等水解酶的能力强，也产生类似黑曲霉的作用。

2.2 发酵产物纯蛋白含量

自然发酵：由表2看出，在自然发酵条件下，原料A不接种发酵剂，仅靠原料及空气中的微生物自然接种，就可以使苹果渣的纯蛋白含量由35.09 g/kg 提高到112.18 g/kg，发酵增率⊿f为219.7%；接种酵母菌+黑曲霉、黑曲霉、酵母菌+米曲霉及米曲霉后，发酵产物中纯蛋白含量较未发酵纯果渣分别提高303.6%、286.3%、285.1%及275.2%；与不接种对照处理相比，发酵剂接种引起的纯蛋白含量增率⊿i为11.2%~26.3%。原料B与之类似，特别是在接种酵母菌+黑曲霉时，纯蛋白含量的发酵增率⊿f及接菌增率⊿i分别为428.3%及55.8%。

灭菌发酵：由表3看出，在灭菌发酵中，发酵能显著增加产物中纯蛋白含量。在原料A中，发酵导致的纯蛋白含量增率⊿f为223.4%~450.5%，其中不接菌处理纯蛋白质增率⊿f为223.4%，与固态发酵期间曲霉孢子落入并生长有关。接菌处理能大幅提高发酵产物纯蛋白含量，向苹果渣接种各供试菌株发酵所得纯蛋白含量为129.65 g/kg~193.17 g/kg，接菌导致的纯蛋白含量增率⊿i为14.2%~70.2%，其中接种酵母菌+黑曲霉时纯蛋白含量较对照增加70.2%。在原料B中，发酵产物中蛋白质含量为124.31g/kg~194.04 g/kg，纯蛋白含量的增率⊿f为254.3%~453.0%；与不接菌对照相比，接菌导致的纯蛋白增率⊿i为17.8%~56.1.0%。

2.3 原料灭菌及添加油渣对发酵产物中纯蛋白含量的影响

由表3中灭菌增率⊿s可以看出，灭菌条件下发酵产物纯蛋白含量均明显大于自然发酵产物纯蛋白含量，原料A和原料B的灭菌增率⊿s分别为1.2%~36.4%和4.5%~13.8%，说明灭菌处理能显著提高发酵产物纯蛋白含量。

由表2、表3看出，在自然及灭菌条件下，原料B与原料A发酵产物纯蛋白含量存在一定差异。在自然发酵中，原料B中纯蛋白含量是原料A的1.2倍左右，灭菌发酵与之类似。此外，在自然发酵中，原料B、原料A 的发酵增率⊿f 分别为239.0%~428.3%、219.7%~303.6%，即原料B的发酵增率高于原料A，表明原料中添加油渣有助于提高发酵产物中的纯蛋白含量及发酵增率。在灭菌发酵中，也呈现出类似趋势。

2.4 发酵产物氨基酸组成

加入氮素及混菌自然发酵条件下，固态发酵不仅可以提高苹果渣的蛋白质含量，同时还可以增加发酵产物中各种氨基酸的含量，改变氨基酸的组成比例，且酵母菌+黑曲霉混菌发酵效果优于酵母菌+米曲霉的混菌接入。由表4 看出，果渣发酵饲料接种酵母菌+米曲霉和酵母菌+黑曲霉后的氨基酸总含量为68.1 g/kg 和81.3 g/kg，与未发酵对照37.3 g/kg 相比较，分别增加了82.2%和117.4%；与此同时，动物9种必需氨基酸总含量也由16.7 g/kg分别增至28.8 g/kg和34.9 g/kg，增率分别为72.3%和108.7%。

由表4 看出，通过酵母菌+米曲霉和酵母菌+黑曲霉混菌发酵的果渣蛋白饲料中，精氨酸（Arg）含量高达3.43 g/kg 和4.12 g/kg；缬氨酸（Val）、异亮氨酸（Ile）含量高达4.39 g/kg、3.48 g/kg和5.28 g/kg、4.17 g/kg；甘氨酸（Gly）含量达到4.05 g/kg和5.07 g/kg，丝氨酸（Ser）含量达到2.17 g/kg 和2.57 g/kg；蛋氨酸含量增加到0.81 g/kg和0.99 g/kg。