HPLC使用中常见你的7个错误

由于没有考虑到使用一些可以替代的办法，目前还有七种传统做法仍然存在于HPLC的技术应用中，而这些做法其实非常不利于HPLC技术的效率提高、运行成本的降低以及运行时间的缩短。本文中我们将提出一些可行的传统做法的替代方法，有些人可能会对这些替代方法出现争议，但如果应用得当的话，这些替代方法势必会产生显著的效果。因为相比不停地机械劳作，分析科学家应该更聪明地工作。
 

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常见错误之一——色谱柱都用粒径5µm的颗粒填充

回想一下，多年来标准HPLC分析柱（250mm×4.6mm）都是采用5µm 粒径颗粒填装的，然而，事实上3µm 粒径颗粒填装的色谱柱（150mm×4.6mm）具有更好的分离效果及更短的分析时间。同时，现在许多实验室标配的色谱仪是超高压液相色谱（UHPLC）和液相色谱-质谱（LC-MS），所以色谱柱更应该换成3µm 或sub-2µm 填装的色谱柱。
 
然而，值得注意的是：3µm 粒径颗粒填装的色谱柱进口孔隙更小，更容易被“脏”的样品堵塞。

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常见错误之二——分析色谱柱以4.6mm内径为标准（1mL/min）

自20世纪70年代初，HPLC分析柱的“标准”内径就已经是4.6mm了，而近年来，在努力减少溶剂消耗、节约样品的目标下，许多实验室已经开始将3.0mm内径的色谱柱作为更好的选择，来代替使用4.6mm内径色谱柱了。如果使用现代的中间分散HPLC仪的话，柱率和柱外频带展宽的效果通常不会受到任何负面影响。总之，使用较小内径的色谱柱是有利的，在梯度洗脱条件下可以获得更高的分辨率。

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常见错误之三——对HPLC的流动相都进行过滤

通常经净化系统所得的HPLC级溶剂和水已经足够干净了，如果我们再给它一次额外的过滤，那只会适得其反，引入不必要的化学污染。事实上，许多实验室都有自己的一套色谱仪器保养维修计划，每年对HPLC系统中的过滤器进行更换，所以我们没有必要再对流动相进一步过滤。

例外的是：如果你使用的是离子对试剂、低纯度缓冲剂或高盐含量的流动相时，仍然强烈建议你对流动相进行过滤。
 
还有一种情况是有必要进行额外过滤的，即如果由于水源的质量不好或者其他原因导致从净化系统流出的水不够干净的时候。
 

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常见错误之四——使用缓冲剂流动相

当分析酸性或者碱性分析物的时候，有必要对流动相进行酸化或者碱化。简单的流动相如含0.1％（体积比）甲酸的水溶液，仅需要将1mL甲酸定容到1升水中即可迅速制备。同样，含0.1％（体积比）氨的水溶液可以用于多种高pH值兼容柱。当使用低硅羟基活性柱时，无论用低还是高pH值流动相运行，缓冲剂其实都很少用到，包括以流动相A为稀释剂配制进样样品溶液时。
 
例外的是：当分析复杂分子、复杂混合物时，可能仍然需要用缓冲剂流动相，以保持高的选择性和特别适中的pH值的流动相。
 

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常见错误之五——每次试验都重新配制新的参考标准溶液

在药品的质量控制实验室中，往往每个试验都会重新配制新的参考标准溶液，实际上这是没有必要的。许多药物在低温和适当的贮存条件下溶液具有足够的稳定性。所以你可以一次性配制几百个合格的参考标准溶液置于HPLC小瓶中，然后冷藏或冷冻贮存供以后分析用。而对于试验结果的长期稳定性研究来说，更应该采用由同一个原始溶液配制而成的标准溶液。当然，对于通常的试验，标准溶液的储存条件下的稳定性（保质期）是应该经过验证的，并记录首次配制时间。这里值得我们注意的是：所有的操作都需要做好记录。

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常见错误之六——对样品瓶进行摇动

 
摇动（或反转）样品瓶会在样品瓶盖下面形成一层液体膜，这会对HPLC自动进样器造成干扰以至于给出一个混乱的试验结果。所以即使在排除了故障的情况下，也要始终警惕这一点。
 
例外的是：如果样品是冷冻过的，那么解冻后，需要进行涡旋或摇动以确保样品均匀。
 

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常见错误之七——使用不锈钢卡套作为柱的接头

HPLC系统通常安装有不锈钢接头和套圈，大多数情况下它们工作得都很好，但是它们不适合用于需要频繁更换色谱柱时的连接。
 
首先，不锈钢卡套只能与为其量身定制的端部管接头相匹配，而对于不同的色谱柱来说这种“量身定制”只会适得其反。
 
其次，预制的不锈钢接头只能够重复密封5-10次。当某些制造商的不锈钢接头用于其他品牌的色谱柱时，由于不同端部接头和插入深度的关系，这个问题会变得尤其明显。
 
一个可能的解决方案是使用可以用手指拧紧的聚醚醚酮（PEEK）管件，它们价格低廉，并且在5000psi（34.47MPa）压力下的密封效果也很好。许多较新的UHPLC接头，其额定压力为20,000psi（137.9MPa），只需用手指拧紧，然后用扳手再转四分之一圈就可以了。

译自：chromatographyonline
来源：材料与测试
译者：cynthia

PS：附赠色谱柱保护的几个步骤。

不要未处理样品就进样

　　在我的LC课堂中，我经常开玩笑的说，延长柱子寿命的最好方法是不要打开色谱柱的盒子。一旦你开始进样，就开始了柱子走向灭亡的道路。样品有两个主要方面可以影响色谱柱—化学性质和物理性质。我们把样品中不要的化学污染物和微型颗粒清除的越好，柱子的寿命就越长。使用SPE(Solide-Phase extraction)，液液萃取和其他技术来除去化学污染物是LCGC中“Sample Prep Perspectives”专栏常有这样的文章，我就不在这里多说了。一言以蔽之，越多的样品前处理，越少的化学污染物进入色谱柱，柱子寿命就越长。你还得平衡一下样品前处理费用和它带来的好处。比如，你买了柱芯和试剂，并加上你投入时间的费用，你在每个样品上SPE的花费会很容易超过5美元，这是可以承受500次进样量的反相柱在每个样品分析上分摊成本的5倍多，这差不多需要将色谱柱进样次数从500次延长至2500次才扯平了。另一方面，如果没有做过任何处理的血浆样品直接进样了，柱子可能就只能进样10次左右。你也要考虑到当更多的样品处理步骤加入的时候的数据质量。我知道，在我们的实验室中，这些措施可以让我们在低浓度的时候收集到有用的数据并得到一致的结果，而不是比较少的前处理步骤可能得到的结果。

　　不论你做没做其他前处理步骤，几乎所有的样品都会从样品过滤，离心或者两者中得到好处。样品经过一个一次性的过滤膜过滤来移除可能堵住柱子进口筛板的细颗粒物。滤膜的孔径不能大于柱子进口筛板的孔径。大部分>3μm填料颗粒的柱子用2μm孔径的筛板，3μm填料粒径的柱子则一般用0.5μm的筛板，填料粒径<3-μm的柱子，比如UHPLC，一般用0.2μm的进口筛板。最常用的样品过滤膜是0.45μm孔径的，这个对除了亚2μm之外的其它柱子都已经足够，亚2μm柱子，则需用0.2μm的滤膜。滤膜可作为预装在一次性注射器中的柱芯，也作为96孔板的过滤板。即使这些过滤装置一般是有效的，但我不是非常强烈的推荐使用。至少有4点使我不同意过滤样品。第一，样品过滤成本比较昂贵，上一次我比较过价格，一次性购买1000份，每份的价格都要高于0.5美元，-这个与柱子在每次分析中的分摊费用几乎一样。第二，用0.5μm滤膜过滤很慢，而0.2μm滤膜则更慢。第三，，每一个样品的处理步骤都必须一样，这就是说，如果你过滤了一个样品，那么其他剩余的样品也都要过滤，无论实际上需不需要。最后，如果你要验证你的LC方法，就需要验证所有的过滤步骤。在过滤的过程中，样品会有损失—如果50μL样品经过滤膜，得到的样品就少于50μL。你得证明样品不是选择性的损失，特别是在高或者低浓度的时候。因此，我们可以看到，样品过滤是需要花很多功夫和金钱的。但是你要是不怕麻烦和不要求成本，样品过滤是在大部分的情况下都是能提高柱子的寿命的。

　　样品过滤的一个替代方法（或者是补充）是在进样之前离心。这是一个简单又相对便宜的方法。只要把样品放进离心管，Eppendorf 离心管或者一个96孔的离心板，再放到小型台式离心机里，调整转速到其最大速度，旋转5-10min。这会使会引起筛板堵塞的颗粒沉积到样品瓶的底部，然后把样品转移到进样瓶或板中继续进行分析。这种技术我们在实验室中对需要沉淀蛋白质样品中已经使用了很多年，而且极少出现颗粒物质相关的问题。我曾经见过这样的例子，用0.2μm的滤膜过滤之后的样品，UHPLC进样，这种样品还是有一点浑浊并且引起了柱子堵塞，但是这个些微浑浊的样品离心至澄清之后，柱子堵塞的情况就会减少很多。

　　使用在线过滤器

　　我非常认同一个在线的过滤器是LC或者UHPLC中使用成本最低的附加装置，可以提供最大的投资回报。这种过滤器是一个非常简单的改装管配件，其中包含了一个特定孔径的筛板，安装在自动进样器和柱子（保护柱，如果用到的话）之间。现在最普遍的装置是一个直径接近37.5px，长度62.5px不锈钢配件，其中包含一个0.5或者0.2μm孔径的可替换的筛板。另外一种装置是包含相同孔径大小筛板的PEEK手紧配件。这种PEEK过滤器整体是一次性的，但是因为它比不锈钢过滤器中的一次性使用的筛板要贵，使用成本会比较昂贵。这种在线过滤器孔径会选择比柱子筛板孔径小一点，因此它会在柱子堵塞之前先被堵塞。当系统压力开始增加的时候，你就知道在线过滤器中筛板已经开始堵了，需要在完全堵住之前替换掉。

　　在线过滤器可以起到单独的样品过滤器一样的功能，但在样品前处理时，不需要额外的人力工作。如果你样品离心了，偶尔有一些颗粒没有过滤掉，也会被下游的在线过滤器拦截住。在线过滤器的另一优点是它能够很便捷的更换—如果你动手能力强，在5min内你可以关掉泵、替换筛板、打开系统并继续实验。你可能想要重新进一针系统适应性样品来检查一下系统有没有出问题，使用在线过滤器不需要大量的调节和校准，而这些更换保护柱时都需要重新做过。在线过滤器的最后一个好处是可以过滤掉泵密封件和进样阀因磨损产生的颗粒物。我强烈建议在每一个LC系统中都安装一个在线过滤器，即使你已经在使用保护柱了。

　　保护柱

　　保护柱（也叫做预柱）是一种很短的装在分析柱上游的色谱柱。这种柱子一般是10-20mm长，包含与分析柱一样的填料，使用不大于分析柱筛板孔径的入口筛板和出口筛板。保护柱有双重功能，第一，入口筛板拦截可能堵塞分析柱的颗粒物，第二，填料与分析柱相同，它可以捕抓住那些可能会强烈或者不可逆附着在分析柱填料上的物质。因此，保护柱会延长分析柱的寿命。

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